Nf-κb, parp-1 inhibitörü olan ag-014699 | onkogen

Nf-κb, parp-1 inhibitörü olan ag-014699 | onkogen

Anonim

soyut

Stres kaynaklı transkripsiyon faktörü, nükleer faktör (NF) -κB proliferasyon ve apoptozda rol oynayan genleri indükler. Aberrant NF-KB aktivitesi kanserde sık görülür ve terapötik dirence katkıda bulunur. Poli (ADP-riboz) polimeraz-1 (PARP-1), DNA iplik kopması onarımı sırasında aktive edilir ve bilinen bir transkripsiyonel yardımcı regülatördür. Burada, p65 küçük girişimci RNA (siRNA), PARP siRNA veya güçlü PARP-1 inhibitörü AG-014699 kullanarak NF-activB aktivasyonu sırasında PARP-1 fonksiyonunun rolünü araştırdık. Sağkalım ve apoptoz analizleri, NF-κB p65 - / - hücrelerinin iyonlaştırıcı radyasyona (IR) p65 + / + hücrelerden daha duyarlı olduğunu gösterdi. P65 siRNA, PARP siRNA veya AG-014699 ile radyo-sensitize p65 + / + ile birlikte inkübasyon, ancak p65 - / - hücreleri değil, PARP-1'in NF-effectsB yoluyla hayatta kalma üzerindeki etkilerine aracılık ettiğini gösterdi. Tek iplikli kopma (SSB) onarım kinetiği ve AG-014699 tarafından SSB onarımı inhibisyonunun etkisi p65 + / + ve p65 - / - hücrelerinde benzerdi. SSB onarımının önlenmesi, p65 - / - hücrelerini radyo-duyarlı hale getirmediğinden, AG-014699 tarafından radyo-duyarlılaştırmanın, NF-KB aktivasyonunun akış aşağı inhibisyonu ve SSB onarım inhibisyonundan bağımsız olduğu sonucuna vardık. PARP-1 katalitik aktivite, IR kaynaklı p65 DNA bağlanması ve NF-κB'ye bağımlı gen transkripsiyonu için gerekliydi, oysa tümör nekroz faktörü (TNF) -a ile muamele edilmiş hücreler için, tek başına PARP-1 proteini yeterliydi. Bu uyarana bağlı diferansiyelin, TNF-a değil IR'den sonra indüklenen poli (ADP-riboz) polimerinin uyarılması yoluyla aracılık ettiğini varsayıyoruz. AG-014699'u kullanarak DNA hasarı ile aktive olan NF-κB'yi hedeflemek, diğer hayati enflamatuar fonksiyonlardan ödün vermeden klasik NF-κB inhibitörlerinde gözlenen toksisiteyi yenebilir. Bu veriler PARP-1 inhibitörlerinin NF-B aracılı terapötik direncin üstesinden gelme potansiyelini vurgulamakta ve bu ajanların kullanılabileceği kanser spektrumunu genişletmektedir.

Giriş

Stres kaynaklı transkripsiyon faktörü, nükleer faktör (NF) -κB apoptoz, hücre proliferasyonu, anjiyogenez ve metastazda rol oynayan genleri düzenlediği bilinmektedir. NF-κB, inhibitör κB (İB) proteinleri ile etkileşimi sayesinde sitoplazmada etkisiz tutulan Rel ailesi proteinlerinin (p50, p52, p65, c-Rel ve Rel B) heterodimerik kompleksidir. Uyarımda, DNA hasarı veya enflamatuar sitokinlerle, NF-κB aktivasyonunun kanonik yolu indüklenir. Kısaca, sinyalleme kaskadları, I phospBa'yı fosforile eden kappa-B kinaz (IKK) kompleksinin inhibitöründe birleşir, bunu hedefleyen p65 / p50 heterodimerinin nükleer translokasyonunu teşvik eder ve anti-apoptotik Bcl- dahil birçok genin transkripsiyonunu aktive eder. XL ve X'e bağlı apoptoz proteini inhibitörü (XIAP) (Ghosh ve Karin, 2002).

Yapısal olarak aktif NF-KB, birçok kanserde ve lösemide yaygındır (Basseres ve Baldwin, 2006) ve kronik lenfositik lösemide (KLL) kötü prognoz ile ilişkili olduğu gösterilmiştir (Hewamana ve ark., 2009). Aberrant NF-KB aktivasyonu, artan metastatik potansiyel, daha hızlı hastalık ilerlemesi, daha yüksek oranda tümör nüksü ve terapötik direnç ile koreledir (Prasad ve ark. 2009). Hücresel NF-κB aktivitesinin, değişen dozlarda iyonlaştırıcı radyasyon (IR) tarafından uyarıldığı bilinmektedir ve bu farklılığın hem hücre tipi hem de dokuya özgü olması muhtemeldir (Brach ve diğerleri, 1991; Criswell ve diğerleri, 2003). DNA hasarı ile aktive olan NF-κB, anti-apoptotik genleri indükler, böylece apoptozu inhibe eder (Wang ve diğerleri, 1998; Barkett ve Gilmore, 1999). Aberrant NF-KB meme tümörlerinde radyo ve kemo direncine katkıda bulunur (Biswas ve diğerleri, 2004; Wu ve Kral, 2005) ve NF-KB'nin kaybının veya inhibe edilmesinin birçok farklı durumda kemo- veya radyo-duyarlılaştırdığı gösterilmiştir tümör tipleri (Jung ve Dritschilo, 2001; Russo ve diğerleri, 2001; Criswell ve diğerleri, 2003; Hewamana ve diğerleri, 2008a, 2008b). Bununla birlikte, aktif NF-KB için gerekli olan IR dozunun hücre tipine veya dokuya bağlı olabileceğini not etmek önemlidir. Örneğin, Brach ve diğ. (1991) klinik olarak ilgili 2 Gy dozunun, KG-1 miyeloid hücre hattında NF-κB aktivasyonunu indükleyebileceğini göstermiştir. Ayrıca, Epstein-Barr virüsü dönüştürülmüş 244B insan lenfoblastoid hücre hattında, 0.5 Gy IR'nin NF-KB aktivasyonunu aktive ettiği gösterilmiştir (Sahijdak ve diğerleri, 1994). Oysa Stilmann ve ark. (2009), bir NF-responseB yanıtını indüklerken 80 ölümcül hiper ölümcül dozları kullanmıştır.

Dolayısıyla, NF-KB'nin inhibisyonu, kanserde potansiyel bir terapötik stratejiyi temsil eder ve gelişimde çeşitli yol bileşenlerini hedef alan bir dizi inhibitör vardır. Bunlar arasında Parthenolide gibi IKK kompleksi inhibitörleri veya IκB'nin bozulmasını önleyebilen Bortezomib gibi proteozomal inhibitörler bulunur. (Gilmore ve Herscovitch, 2006). Yeni bir strateji, genellikle IKK veya proteosmal inhibitörleri ile karşılaşılan toksik veya hedef dışı etkilerin üstesinden gelmek için DNA hasarına bağlı NF-κB aktivitesinin inhibe edilmesi olabilir. Burada, Pfizer ile işbirliği içinde Newcastle Üniversitesi'nde geliştirilen ve özellikle DNA hasarına bağlı NF-κB aktivitesinin inhibe edilmesinde geliştirilen, poli (ADP-riboz) polimeraz (PARP) inhibitörü AG-014699 için yeni bir işlevi tarif ediyoruz.

PARP-1, DNA hasarına hücresel cevabı modüle eden bir nükleer enzimdir (Smith, 2001) ve daha önce PARP-1'in IR'ye cevap olarak hem tek hem de çift sarmallı DNA kırılmaları için bir sensör görevi gördüğünü göstermiştik (Veuger). ve arkadaşları, 2003). Daha yakın zamanlarda, PARP-1'in transkripsiyon faktörlerinin birlikte düzenlenmesinde rol oynadığına dair kanıtlar vardır. Bu, kromatin yapısının lokal modifikasyonu (Althaus ve diğerleri, 1994) ve / veya gen düzenleyici sekanslara doğrudan bağlanma yoluyla transkripsiyon faktörü aktivitesinin modülasyonu veya Oct-1, NF-κB içeren transkripsiyon faktörleri içeren proteinlerle fiziksel etkileşimler yoluyla olabilir. , AP-1 ve HIF-la (Kraus ve Lis, 2003; Martin-Oliva ve diğerleri, 2006). Daha önce PARP-1 aktivitesinin, meme kanseri hücre çizgileri panelini ve PARP-1, AG-14361'in küçük moleküllü inhibitörünü kullanarak IR'yi takiben NF-ationB aktivasyonu için hayati önem taşıdığını göstermiştik (Veuger ve ark., 2009).

PARP-1 katalitik aktivitesinin NF-ationB'nin aktivasyonundaki rolü biraz çekişmelidir ve esas olarak uyarana, ayrıca hücre tipine de bağlı olması muhtemeldir (Hassa ve Hottiger, 1999; Oliver vd., 1999; Hassa vd. ve ark., 2001). Bu çalışmada, bunu iki kanonik aktivatör NF-KB, IR ve tümör nekroz faktörü (TNF) -a ile karşılaştırarak test ettik. TNF-a, hem ölüm reseptörünün aracılık ettiği hücre ölümünü hem de NF-B'nin kanonik aktivasyonunu başlatabilen immün yanıt sırasında salınan bir sitokindir (Clevers, 2004). PARP-1'in NF-κB'nin uyarılmasında farklı şekilde gerekli olduğunu ve bunun uyarıcıların poli (ADP-riboz) (PAR) polimerini aktive etme kabiliyetine bağlı olduğunu göstermektedir. Bu amaçla Stilmann ve ark. (2009), DNA hasarına karşı mutasyona uğramış (ATM) NF-essentialB esansiyel değiştiricisi (NEMO), aktif protein tor (PIASγ) protein inhibitörü ile doğrudan protein-protein etkileşimleri yoluyla bir PARP-1 sinyal iskele oluşumunu açıklamaktadır. Bu sinyalozom oluşumu PAR polimerine bağlanmayı gerektirir ve sağkalım yanlısı NF-KB aktivasyonuna yol açar (Stilmann ve diğerleri, 2009).

Güçlü ve spesifik PARP-1 inhibitörü olan AG-014699, katı kemerler için standart kemoterapötiklerle kombinasyon halinde ve ayrıca bağımsız bir tedavi olarak faz I ve II klinik çalışmalarında kullanılmıştır (Plummer vd., 2008). Çalışmalar ayrıca AG-014699'un ksenograft modellerinde tümör regresyonunu arttırdığını göstermiştir (Daniel ve ark. 2009). Bununla birlikte, bu ajanın NF-B transkripsiyonel aktivite üzerindeki etkisi henüz belirlenmemiştir. Burada, PARP-1'in IR'ye apoptotik cevabını pozitif olarak modüle eden NF-KB p65 ve NF-KB p65 için yeterli ve eksik fare embriyonik fibroblastlarını (MEF) hedef alan AG-014699 ve küçük girişimci RNA (siRNA) kullanılarak gösterilmektedir. Dikkat çekici bir şekilde, PARP-1 inhibisyonu ile radyo-duyarlılaştırmanın sadece NF-κB'nin inhibisyonundan kaynaklandığını ve DNA onarımının önlenmesinden kaynaklanmadığını gösterdik. Ayrıca PARP-1'in NF-KB'nin indüksiyonunda farklı şekilde gerekli olduğunu ve bunun aktivasyon uyarıcısına ve bu uyarıcıların PAR polimerini aktive etme yeteneğine bağlı olduğunu gösterdik.

Sonuçlar

Hücre hatlarının karakterizasyonu

Western analizlerini kullanarak tüm hücre hatlarındaki p50, p65 ve PARP-1 durumunu kullanarak daha önce onayladık. Kısaca, nakavt MEF'ler, diğer proteinler için benzer yoğunluktaki bantları gösterirken, ilgili proteinlerden yoksundur (Veuger ve ark., 2009). PARP-1 aktivitesi, PARP + / +, p65 + / + ve p65 - / - MEF'lerde çok benzer ve burada kullanılan PARP-1 - / - MEF'lerde çok düşük (<% 5) (Veuger vd., 2009) . 50 nM p65 siRNA'nın geçici transfeksiyonu, p65 proteininin yıkılmasına yol açtı ve bu, 48 saat boyunca maksimum (% 95 azalma) (Şekil 1a) idi ve 72 saate kadar devam etti. Benzer şekilde, 50 n M PARP-1 siRNA'nın transfeksiyonu (Şekil 1b), 48 saatte yaklaşık% 75 protein yıkımına neden oldu ve bu, 72 saate kadar devam etti. Spesifik olmayan (NS) siRNA'nın protein ekspresyonu üzerinde etkisi yoktu.

Image

Hücre çizgilerinin ve siRNA yıkımının karakterizasyonu. ( a ) Yalnızca araçla (sahte), NS siRNA veya p65 siRNA ile transfeksiyondan 48 saat sonra p65 + / + ve p65 - / - MEF'lerin tam hücre özütlerinin Western lekeleri. ( b ) Yalnızca araçla (sahte), NS siRNA veya PARP-1 siRNA ile transfeksiyondan 48 saat sonra p65 + / + ve p65 - / - bütün hücre özütlerinin Western lekeleri. ( c ) PARP oluşumunu ölçen doğrulanmış bir immünoblot deneyi kullanılarak ölçülen PARP aktivitesini gösteren histogram, yalnızca araçla (sahte), p65 siRNA, AG-014699, PARP-1 siRNA, bir kombinasyon ile transfeksiyondan sonra p65 + / + MEF'ler cinsinden ölçülür. p65 siRNA + AG-014699 veya NS siRNA. ( d ) Tek başına araçla (sahte), p65 siRNA, AG-014699, PARP-1 siRNA, bir p65 siRNA + kombinasyonu ile transfeksiyonu takiben p65 - / - MEF'lerde PAR polimer oluşumunu ölçen doğrulanmış bir immünoblot deneyi kullanılarak ölçülen PARP aktivitesi PAR oluşumunu ölçmek için AG-014699 veya NS siRNA 10H antikoru kullanılmıştır. Veriler, üç bağımsız deneyin ortalama ± sem olarak temsil edilir. * Sahte muamele görmüş kontrole göre anlamlılık, eşleştirilmemiş Student t testi ile P <0.05 idi.

Tam boy görüntü

PARP yıkımını ve AG-014699 özgüllüğünü doğrulamak için PARP aktivitesi, PARP-1 veya p65 siRNA ile transfeksiyonu takiben veya AG-014699 ile muameleyi takiben (Şekil 1c ve d), p65 + / + ve p65 - / - MEF'lerde değerlendirildi. Ayrıca p65 siRNA ve AG-014699'un bir kombinasyonu da değerlendirildi. AG-014699 ya da bir AG-014699 ve p65 siRNA kombinasyonu ile muamele edilen hücreler, çok düşük (<% 5) PARP aktivitesi sergilemiştir (sırasıyla, NS siRNA kontrollerine kıyasla, sırasıyla P = 0.03 ve P = 0.02). PARP-1 siRNA, batı analizini teyit eden her iki hücre hattında da kontrollerle karşılaştırıldığında% 25 PARP aktivitesi gösterdi ( P = 0.004). siRNA hedefleme p65, NS siRNA kontrolleri ile karşılaştırıldığında, her iki hücre hattındaki PARP-1 aktivitesi üzerinde önemli bir etkiye sahip değildir. NS siRNA'yı sahte muamele görmüş kontrollerle karşılaştırırken bir etkisinin olduğu belirtilmelidir. Diğer grupların hücre yaşayabilirliği, proliferasyon, hücre döngüsü dağılımı, apoptoz ve göç gibi hücresel süreçler üzerindeki etkileri belgelenmiştir (Jackson ve Linsley, 2004; Tschaharganeh ve diğerleri, 2007). Burada bunun NS siRNA ile işleme tabi tutulmuş hücrelerde, sahte transfekte edilmiş kontrollere karşı artan nükleik asit oranından kaynaklanabileceğini ve hücrelerin biraz strese neden olabileceğini öne sürüyoruz.

P65 devirme, PARP-1 devirme veya AG-014699 ile radyo-duyarlılaştırma apoptozun indüksiyonu ile ilişkilidir

Kolon oluşturucu kullanarak p65 devirme, PARP-1 devirme veya AG-014699'ın p65 + / + ve p65 - / - MEF'leri ve PARP-1 + / + ve PARP-1 - / - MEF'leri duyarlı hale getirme yeteneğini araştırdık. tahliller. Ayrıca p65 siRNA ve AG-014699 kombinasyonunu değerlendirdik. Önceki çalışmamızda PF50 değerleri, p65 - / - MEF'lerin, p65 + / + MEF'lere kıyasla yalnızca IR'ye karşı 1.3 kat daha duyarlı olduğunu göstermiştir (Veuger ve diğerleri, 2009) (Şekil 2a ve b). Bu, radyo direnci veren NF-κB ile tutarlıdır (Biswas ve diğerleri, 2004; Wu ve Kral, 2005). Burada, AG-014699, p65 siRNA veya PARP-1 siRNA ile radyo-duyarlı p65 + / + MEF'lerle birlikte inkübasyonun, IR ile muamele edilmiş sahte transfekte edilmiş hücrelere kıyasla 1.4 kat olduğunu göstermektedir. Anlamlı bir şekilde, p65 siRNA ve AG-014699'un bir kombinasyonu başka bir hassasiyet göstermedi (Şekil 2a). Belirgin bir şekilde, bu tedavilerin p65 - / - MEF'lerde etkisi olmamıştır (Şekil 2b). PARP-1 - / - MEF'ler, PARP-1 + / + MEF'ler ile karşılaştırıldığında IR'ye 2, 7 kat daha duyarlıydı (Şekil 2c'ye karşı d). PARP-1 + / + MEF'ler, yalnız IR kontrollerine kıyasla, AG-014699, p65 devrilme veya PARP-1 devrilme tarafından IR'ye 1.3 kat duyarlılık sergilediler (Şekil 2c).

Image

P65 devirme, PARP-1 devirme veya AG-014699 ile radyo-duyarlılaştırma apoptozun indüksiyonu ile ilişkilidir. Artan IR dozlarının tek başına veya p65 siRNA, AG-014699, PARP-1 siRNA veya bir p65 siRNA ve AG-014699 kombinasyonu ile birlikte inkübe edilmesi, klonojenik hayatta kalma deneyi kullanılarak değerlendirildi. Hücreler, ilgili siRNA (veya araç kontrolü) ile muamele edildi, 48 saat bekletildi, AG-014699 ile ön işleme tabi tutuldu veya IR'den 1 saat önce dimetilsülfoksit kontrolü ile muamele edildi, daha sonra 24 saat sonra tekrar kaplandı ve 7-21 gün boyunca koloniler oluşturmaya bırakıldı . (Hayatta kalma eğrisi ( a ) p65 + / + MEF, ( b ) p65 - / - MEF, ( c ) PARP + / + MEF ve ( d ) PARP - / - MEF) gösterir. ( e ) Yalnız IR'nin (sahte, beyaz çubuk) ± p65 siRNA (siyah çubuk) ± AG-104699'un (yalnız AG, açık gri çubuk, AG + p65 siRNA, koyu gri çubuk) p65 + ' daki apoptozis indüksiyonu üzerindeki etkisi / + MEF'ler. Hücreler ilgili siRNA ile muamele edildi veya kontrol 48 saat bekletildi, AG-014699 ile ön işleme tabi tutuldu veya IR'den 1 saat önce kontrol edildi, sonra ekin V floresanla aktive edilmiş apoptoz indüksiyonunun toplanması ve değerlendirilmesinden önce 24 saat daha tamir etmesine izin verildi. hücre sıralama (FACS) analizi. Gösterilen sonuçlar, tedavi edilmeyen kontrollere normalleştirilir. ( f ) IR (sahte, beyaz çubuk) ± p65 siRNA (siyah çubuk) ± AG-104699'un (yalnız AG, çizgili çubuk, AG + p65 siRNA, çizgili çubuk) p65 - / - MEF'lerde apoptozisin indüksiyonu üzerine etkisi . Hücreler, ilgili siRNA ile muamele edildi veya 48 saat süreyle kontrol bırakıldı, AG-014699 ile ön işleme tabi tutuldu veya IR'den 1 saat önce kontrol edildi, sonra ekin V FACS analiziyle apoptoz indüksiyonunun hasat edilmesinden ve değerlendirilmesinden önce 24 saat daha tamir etmesine izin verildi. Gösterilen sonuçlar, tedavi edilmeyen kontrollere normalleştirilir. Gösterilen tüm veriler, üç bağımsız deneyin ortalama ± sem olarak temsil edilir. * Sahte muamele görmüş kontrole göre anlamlılık, eşleştirilmemiş Student t testi ile P <0.05 idi.

Tam boy görüntü

Bu koloni oluşturan deneyleri sadece IR ile veya AG-014699 ile kombinasyon halinde, vahşi tipte (WT) p65 ile genetik olarak tamamlanmış p65 - / - hücrelerinde ve ilgili kontrol hücrelerinde de tekrarladık (Ek Şekil 1B) ve C). Şekil 1a ve b'deki verilerle birlikte, sulandırılmış hücrelerden elde edilen sonuçlar, AG-014699'un WT p65 içeren, ancak p65 null hücreleri içermeyen radyo-duyarlı hücrelerin olduğunu doğrulamaktadır.

Apoptoz üzerindeki etkileri değerlendirmek için, membran fosfolipid fosfatidilserin için yüksek afiniteye sahip olan flüoreserin izotiyosiyanat konjuge ekin V'i kullandık. Öncelikle, p65 - / - MEF'lerin IR sonrası p65 + / + ile karşılaştırıldığında üç kat daha yüksek intrinsik apoptoz seviyelerine sahip olduklarını bulduk (p65 + / + için 33, 73 ± 3, 1, p65 + / + için 12, 60 ± 2, 7, p65 + / + için gösterilmemiştir). Bu, NF-κB aktivasyonunun DNA hasarının ardından sağkalımı arttırdığı raporları ile tutarlıdır (Wang ve diğerleri, 1996; Russo ve diğerleri, 2001; Criswell ve diğerleri, 2003). Daha sonra IR (2 veya 5 Gy) ve p65 düşürme veya p65 + / + ve p65 - / - MEF'lerde AG-014699'dan sonra apoptoz seviyelerini ölçtük (Şekil 2e, f'ye karşı). Ayrıca p65 siRNA ve AG-014699 (Şekil 2e) kombinasyonunu değerlendirdik. Sadece IR ile karşılaştırıldığında (sahte), hem p65 devirme hem de AG-014699, p65 + / + MEF'lerde IR'yi takiben apoptozu anlamlı şekilde arttırdı (yaklaşık 2.5 kat) (sırasıyla P = 0.03 ve P = 0.04). Önemli olarak, AG-014699, p65 devrilme ile birlikte kullanıldığında, p65 + / + MEF'lerde apoptoz seviyesinde tek başına iki maddeyle karşılaştırıldığında değişiklik olmadı. Yalnızca IR ile karşılaştırıldığında yapılan tedavilerden herhangi birinde p65 - / - MEF'lerde (Şekil 2f) apoptozda artış görülmedi. Bu veriler bir kaspaz aktivite deneyi (Promega, Southampton, UK), (veriler gösterilmemiştir) kullanılarak doğrulanmıştır.

AG-014699, tek telli kopma (SSB) onarımını, hücresel NF-KB durumundan bağımsız olarak benzer ölçüde engeller

Alkalin Comet tahlili, IR kaynaklı SSB oluşumunu incelemek ve bireysel hücre seviyesinde tamir etmek için kullanıldı. Onarımın kinetiği p65 + / + ve p65 - / - hücre hatlarında değerlendirildi (Şekil 3c ve d). Şekil 3, 10 Gy IR'den hemen sonra, her iki hücre çizgisinin de aynı başlangıç ​​SSB seviyesine sahip olduğunu göstermektedir. IR'den 60 dakika sonra iki hücre çizgisinde kalan SSB seviyelerinde anlamlı bir fark yoktu ve radyo duyarlılığındaki farka rağmen kırılmaların>% 85'i yeniden birleşti. Önemli olarak, AG-014699, her iki hücre hattında da SSB onarımını (IR sonrası tüm zaman noktalarında artan SSB seviyeleri ile gösterildiği gibi) inhibe etti (her iki hücre hattında da aynı şekilde) (Şekil 3a ve b). Ayrıca, bu deneyleri WT p65 ile genetik olarak tamamlanmış p65 - / - hücrelerinde ve ayrıca p65 boş kontrollerinde tekrar ettik. Önemli olarak, hem SSB onarım kinetiğinin hem de AG-014699 tarafından SSB inhibisyonunun her iki hücre hattında çok benzer olduğunu bulduk (Şekil 3e ve f). Tüm Comet deneyleri için, yüzde kuyruk DNA'sı Ek Şekil 2'de gösterilmektedir.

Image

AG-014699, hücresel NF-KB durumundan bağımsız olarak SSB onarımını benzer bir şekilde önler. ( A ) p65 + / + MEF ve ( b ) p65 - / - 10 Gy IR ± AG-014699 (AG, + ile gösterilir) ile muamele edilmiş ve tamirine izin verilen (0) 'da SSB'lerin (SSBs) kapsamını gösteren şemalar, 15, 30 ve 60 dk). SSB onarımı, alkalin COMET tahlili kullanılarak ölçüldü ve Olive Tail momenti (burada gösterilmiştir) hem tespit edilebilir en küçük boyutta göç eden DNA'nın (kuyrukluyıldız kuyruk uzunluğuna yansıyan) hem de rahat / kırılmış parçaların (ölçüm ile gösterilir) bir ölçüsü olarak kullanıldı. kuyruğundaki DNA yoğunluğu). Tüm veriler Gauss dağılımı için test edildi ve gösterilen çizgiler, çizilen verinin ortalamasını göstermektedir. SSB onarımının kinetiğini p65 + / + ( c ) ve p65 - / - MEF ( d ) 'de gösteren çizgi grafik. Veriler ilgili kontrollere normalleştirilir ve her iki durumda da katı siyah çizgiler, 10 Gy IR ile muamele edilen hücrelerin zaman içindeki onarımını ve noktalı çizgiler, 10 Gy IR + AG-014699 ile muamele edilen hücrelerin zaman içindeki onarımını temsil eder. WT p65 ve ( f ) p65 - / - (kontrol) 10 Gy IR ± AG-014699 (AG, + ile gösterilen) ile izin verilen MEF'lerde ( e ) p65 - / - MEF'lerde SSB'lerin kapsamını gösteren dağılım diyagramları onarmak için (0, 15, 30 ve 60 dak.). SSB onarımı alkalin COMET testi kullanılarak ölçüldü ve Olive Tail momenti burada gösterildi. Tüm veriler Gauss dağılımı için test edildi ve gösterilen çizgiler dağılımın ortalamasını gösteriyor. Gösterilen tüm sonuçlar üç bağımsız deneyin ortalaması ± sem

Tam boy görüntü

PARP aktivitesi, TNF-α değil IR sonrası NF-FB aktivasyonu için gereklidir.

P65'in, p65 + / + veya p65 - / - MEF'lerde IR veya TNF-a'yı takiben konsensüs sekansı ile bağlanma yeteneğini araştırdık. Her iki uyaranın p65 DNA'sı bağlanma aktivasyonundan 2 saat sonra maksimum olduğu tespit edildi (Ek Şekiller 3C ve D). Bağlanma spesifik olarak aşırı WT oligonükleotidi ile rekabet etti ve aşırı mutant oligonükleotidi ile birlikte inkübasyondan etkilenmedi (veriler gösterilmemiştir). 10 Gy IR, sahte işlem görmüş p65 + / + hücrelerine kıyasla DNA bağlama aktivitesini iki kat arttırdı (Şekil 4a). Ayrıca, p65'i hedefleyen siRNA veya p65 siRNA ve AG-014699'un bir kombinasyonu, p65 + / + hücrelerinde IR'yi takiben DNA bağlanmasını>% 85 azalttı (sırasıyla, sadece IR ile karşılaştırıldığında P = 0.008 ve P = 0.009). PARP-1 siRNA, DNA bağlanmasını yaklaşık olarak% 60 oranında inhibe etti (IR'ye kıyasla P = 0.03). Belirgin bir şekilde, AG-014699 ayrıca, IR kaynaklı DNA bağlanmasını, tedavi edilmeyen kontrollerle karşılaştırılabilir seviyelere indirgemiştir ( P = 0.05, IR'ye kıyasla). NS siRNA, IR sonrası DNA bağlanması üzerinde hiçbir etkiye sahip değildi. 10 ng / ul TNF-a, sahte muamele edilmiş p65 + / + hücrelere kıyasla p65 DNA-bağlama aktivitesini 2.3 kat arttırdı. p65 siRNA veya p65 siRNA ve AG-014699'un bir kombinasyonu, TNF-a'yı takiben sahte muamele görmüş kontrollere göre seviyelere DNA bağlanmasını azaltmıştır (sırasıyla, sadece TNF-a'ya kıyasla P = 0.009 ve P = 0.007). Önemli olarak, PARP-1 siRNA, TNF-a işleminden sonra DNA bağlanmasını% 25 azalttı ( P = 0.02, TNF-a'ya kıyasla). Belirgin bir kontrast olarak, AG-014699, TNF-a'yı takiben p65 DNA bağlanması üzerinde hiçbir etkiye sahip değildi. İhmal edilebilir p65 DNA bağlama aktivitesi, IR veya TNF-a'ya sahip p65 - / - hücrelerinde yapılan herhangi bir tedaviden sonra görülmüştür (veriler gösterilmemiştir).

Image

PARP aktivitesi, TNF-α değil IR'den sonra NF--B aktivasyonu için gereklidir. IR veya TNF-α ± p65 siRNA ± AG-014699 (AG) ± PARP-1 siRNA ± (p65 siRNA + AG-014699) ± NS siRNA kontrolünün NF-DNAB DNA bağlama aktivitesi üzerindeki etkisini gösteren bir enzim kullanılarak yapılan histogram p65 + / + MEF'lerde bir lusiferaz raportör tahlili kullanılarak ölçülen, bağlanmış immünosorbent tahlili bazlı analiz ( a ) ve ( b ) NF-κB'ye bağlı transkripsiyonel aktivasyon. Açık çubuklar IR, siyah çubuklar TNF-α. Tüm sonuçlar sem ile üç bağımsız deneyin ortalamasıdır. ** Sahte muamele görmüş kontrole göre anlamlılık, eşleştirilmemiş Student'in t- testi kullanılarak P <0.01 idi. * Sahte muamele görmüş kontrole göre anlamlılık, eşleştirilmemiş Student t testi ile P <0.05 idi. ( C ) IR veya TNF-a ( d ) ± p65 siRNA ± AG-014699 (AG) ± PARP-1 siRNA ± (p65 siRNA + AG-014699) ± NS siRNA kontrolünü takip eden p65'in nükleer translokasyonunu gösteren Western blot verileri p65 + / + MEF'ler. Hücreler ilgili siRNA veya kontrol ile muamele edildi, 48 saat süre ile bırakıldı, AG-014699 ile önceden muamele edildi veya IR'den 1 saat önce kontrol edildi ve IR'den 1 saat sonra toplandı. Tüm durumlarda yükleme, lamin nükleer yükleme kontrolüne normalleştirildi. PARP aktivitesini gösteren histogram, IR ( e ) ve TNF-a ( f ) dozlarının arttırılmasından sonra, p65 + / + MEF'lerde PAR polimer oluşumunu ölçen doğrulanmış bir immünoblot analizi kullanılarak ölçülmüştür.

Tam boy görüntü

PARP-1'in IR veya TNF-a'dan sonra NF-B'ye bağımlı raportör gen transkripsiyonundaki rolünü değerlendirmek için, bir lusiferaz raportör tahlili kullanıldı. Lusiferaz aktivitesi, IR veya TNF-a tedavisinden en fazla 8 saat sonra ve ayrıca p65 + / + MEF'lerde doza bağımlı olarak bulundu (veriler gösterilmemiştir). Artan DNA bağlanmasıyla uyumlu olarak, 10 Gy IR veya 10 ng / ul TNF-a'yı takiben, lusiferaz aktivitesi, sahte muamele görmüş kontrollere kıyasla sırasıyla 2- ve 2.5 kat arttırıldı (Şekil 4b). Ayrıca, siRNA'yı hedefleyen p65 veya p65 siRNA ve AG-014699 kombinasyonu, IR (sırasıyla P = 0.008 ve P = 0.007) veya TNF-a (sırasıyla P = 0.02 ve P = 0.03) takip eden lusiferaz aktivitesini>% 80 azaltmıştır. p65 + / + hücreler. PARP-1 siRNA, her iki uyaranın ardından lusiferaz aktivitesini yaklaşık% 70 oranında inhibe etti ( P = 0.01, IR ile karşılaştırıldığında, P = 0.04, TNF-a ile karşılaştırıldığında). Belirgin bir şekilde, AG-014699 ayrıca IR kaynaklı lusiferaz raportör aktivitesini muamele edilmemiş kontrollerle karşılaştırılabilir seviyelere indirgemiştir ( P = 0.02). Bununla birlikte, AG-014699, diğer raporlarla tutarlı olarak, sadece TNF-a'ya kıyasla TNF-a'yı takiben lusiferaz aktivitesi üzerinde hiçbir etkiye sahip değildi (Hassa ve diğerleri, 2001). Daha önce PARP-1 + / + MEF'lere kıyasla kurucu lusiferaz ekspresyonunun PARP-1 - / - MEF'lerde yaklaşık 10 kat daha düşük olduğunu ve IR'nin PARP-1 - / - MEF'lerde gen transkripsiyonunu aktive edemediğini daha önce göstermiştik. fakat PARP-1 + / + MEF'lerde açıkça uyarılmış lusiferaz ekspresyonu (Veuger ve diğerleri, 2009).

Ayrıca, burada IR veya TNF-a'dan 2 saat sonra gözlemlenen p65 + / + MEF'lerde p65'in nükleer translokasyonunun (Şekil 4c ve d), AG-014699 veya PARP-1 siRNA'dan etkilenmediğini gösterir. Sitoplazmik kontroller Ek Şekil 3A ve B'de gösterilmektedir.

IR, TNF-α değil, PAR polimer oluşumunu uyarır

PARP aktivitesinin indüksiyonu, PAR polimerinin oluşumu ile doğrulanmış bir analiz kullanılarak belirlendi (Plummer ve diğerleri, 2005a, 2005b; Zaremba ve diğerleri, 2009). IR'nin PARP aktivitesini uyardığı ve burada, IR ile PAR polimer oluşumunu p65 + / + MEF'lerde doza bağlı bir şekilde indüklediğini gösterdiğimize dair kanıtlar mevcuttur (Şekil 4e). Bununla birlikte, TNF-α'nın, p65 + / + MEF'lerde bazal düzeylerle karşılaştırıldığında, PAR oluşumunu uyarmadığını (5-50 ng / ul) bir doz aralığında (5-50 ng / ul) bulduk.

PARG inhibisyonunu takiben NF-DNAB DNA bağlanmasının kalıcılığı

Poli (ADP-riboz) glikohidrolaz (PARG), PAR polimerinin katabolizmasından sorumlu olan enzimdir. Tüm hücrelerde ve dokularda her zaman düşük seviyelerde eksprese edilir (Bonicalzi ve ark., 2005'te gözden geçirilmiştir). Burada, PARG, ADP-HPD (adenosin kofosfat (hidroksimetil) pirolidiniliol) (Slama ve diğerleri, 1995) ve doğrulanmış PARP deneyinin (Zaremba ve diğerleri, 2009) güçlü ve spesifik inhibitörlerini kullandık. ADP-HPD ile inkübasyon, PAR polimerinin IR ile muamele edilmiş hücrelerde artan stabilite ile sonuçlanır. Normal koşullar altında, polimer bozunur ve IR'yi takiben 1-2 saat bazal seviyelere geri döner, oysa ADP-HPD ile muamele edilmiş hücrelerde polimer, IR sonrası 4 saat sonra devam eder.

Ayrıca, artan polimer stabilitesi, Şekil 5b'de gösterildiği gibi NF-DNAB DNA bağlanmasındaki bir kalıcılıkla ilişkilidir. DNA bağlanması, hızlı bir şekilde düşmeden ve IR sonrası bazal seviyelere geri dönmeden önce IR sonrası maksimum 2 saattir. Belirgin bir şekilde, ADP-HPD ile muamele edilmiş hücrelerde DNA bağlanması, IR sonrası maksimum 2 saattir ve bu, 8 saate kadar devam eder. Artan NF-κB DNA bağlanması ile uyumlu olarak, radyo direncini sağlar (Biswas ve diğerleri, 2004; Wu ve Kral, 2005), burada, ADP-HPD ile tedavinin hücre IR'ye karşı koruduğu klonojenik sağkalım testini (Şekil 5c) kullanarak gösterdik. kaynaklı hücre p65 + / + hücrelerinde öldürür. Ayrıca, p65 - / - hücrelerinde sağkalım üzerinde bir etkisi yoktur (veriler gösterilmemiştir). Bu bulguların fizyolojik olarak anlamlı olduğunu göstermek için, PARG inhibisyonunun, p65 + / + hücrelerinde bilinen bazı NF-κB aracılı anti-apoptotik genlerin ekspresyonunda bir artışa yol açıp açmadığını belirlemeye devam ettik. Kantitatif ters transkriptaz-PCR kullanarak, IR'nin Bcl-xL ekspresyonunu anlamlı şekilde arttırdığını (tedavi edilmeyen kontrollere kıyasla P = 0.04) ve bunun sadece ADP-HPD ile birlikte kuluçka ile arttırıldığını (sadece ADP-HPD ile karşılaştırıldığında P = 0.0089) arttırdığını göstermektedir. kontroller) (Ek Şekil 4A). CASP8 ve FADD benzeri apoptoz düzenleyici (cFLAR) ekspresyonu (Ek Şekil 4B), IR ( P = 0.103) sonrasında da arttırıldı ve bu, ADP-HPD ile birlikte inkübasyonla önemli ölçüde arttırıldı ( P = 0.0098). Ayrıca XIAP ifadesi ile benzer bir eğilim gözlemledik (Ek Şekil 4C).

Image

PARG inhibisyonunu takiben NF-DNAB DNA bağlanmasının kalıcılığı. ( a ) 10 Gy IR ± ADP-HPD (açık çubuklar IR, siyah çubuklar IR + ADP-HPD) sonrasında p65 + / + MEF'lerde PAR polimer oluşumunu ölçen doğrulanmış bir immünoblot tahlili kullanılarak ölçülen PARP aktivite zaman dilimini gösteren histogram. ( b ) IR ± ADP-HPD (açık çubuklar IR, siyah çubuklar IR + ADP-HPD) 'den sonra enzim bağlı immünosorbent testi bazlı bir yöntem kullanılarak ölçülen NF-DNAB DNA-bağlama zaman akışını gösteren histogram. ( c ) Artan IR dozlarının, tek başına (katı çizgi) veya ADP-HPD (kesikli çizgi) ile birlikte inkübe edilmiş hücre sağkalımı üzerindeki etkileri, p65 + / + MEF'lerde klonojenik sağkalım kullanılarak değerlendirildi. Hücreler ADP-HPD ile ön işleme tabi tutuldu veya IR'den 1 saat önce kontrol edildi, daha sonra 24 saat sonra tekrar kaplandı ve 7-21 gün boyunca koloniler oluşturmaya bırakıldı. Tüm sonuçlar sem ile üç bağımsız deneylerin ortalamasıdır

Tam boy görüntü

AG-014699, glioblastomdaki NF-κB aracılı terapötik direncin üstesinden gelir

Western blot kullanarak, U251 glioblastoma hücrelerinde p65 ve PARP-1'in durumunu doğruladık. Bu proteinleri yıkmak için p65 veya PARP-1'i hedeflemek için siRNA'yı kullandık (Şekil 6a ve b) ve koloni oluşturan deneyleri kullanarak U251 hücrelerini IR'ye duyarlı hale getirme yeteneğini araştırdık. Ayrıca p65 siRNA ve AG-014699 kombinasyonunu değerlendirdik. P65 + / + MEF'lerde gözlemlenen sonuçlara benzer şekilde, burada, AG-014699, p65 siRNA veya PARP-1 siRNA ile birlikte inkübasyonun, tedavi edilen sahte transfekte edilmiş hücrelere kıyasla 2.4 kat radyo hassaslaştırmasına yol açtığını gösterdik. IR ile. Yine, p65 siRNA ve AG-014699 kombinasyonu daha fazla hassasiyet göstermedi (Şekil 6d).

Image

AG-014699, U251 glioblastoma hücrelerini NF-κB'nin inhibisyonu yoluyla radyo-duyarlı hale getirir. ( a ) yalnız araç (transfeksiyon), NS siRNA veya p65 siRNA ile transfeksiyondan 48 saat sonra U251 hücrelerinin bütün hücre özütlerinin Western lekeleri. ( b ) Yalnız araç (taklit), NS siRNA veya PARP-1 siRNA ile transfeksiyondan sonra 48 saatte U251 hücrelerinin bütün hücre özütlerinin Western lekeleri. ( c ) IR ± p65 siRNA ± AG-014699 (AG) ± PARP-1 siRNA ± (p65 siRNA + AG-014699) ± NS siRNA kontrolünün bir enzim kullanılarak ölçülen NF-κB DNA-bağlanma aktivitesi üzerindeki etkisini gösteren histogram bağlı immünosorbent deneyi bazlı deney. Tüm sonuçlar sem ile üç bağımsız deneyin ortalamasıdır. ** Sahte muamele görmüş kontrole göre anlamlılık, eşleştirilmemiş Student'in t- testi kullanılarak P <0.01 idi. ( d ) Artan IR dozlarının tek başına veya p65 siRNA, AG-014699, PARP-1 siRNA veya p65 siRNA ve AG-014699 kombinasyonu ile birlikte inkübe edilmesinin U251 hücre sağkalımı üzerindeki etkileri klonojenik sağkalım kullanılarak değerlendirildi deney. Hücreler, 48 saat süre ile bırakılan, AG-014699 ile önceden muamele edilmiş, 48 saat süreyle bırakılan ilgili siRNA (veya araç kontrolü) ile muamele edildi, daha sonra 24 saat sonra tekrar kaplandı ve 7-21 için koloniler oluşturmaya bırakıldı günler. ( e ) 10 Gy IR ± AG-014699 (+ ile gösterilir) ile tedavi edilen ve (0, 15 ve 30 dak) tamir edilen U251 hücrelerinde SSB'lerin kapsamını gösteren dağılım diyagramları. SSB onarımı, alkalin COMET tahlili kullanılarak ölçüldü ve Olive Tail momenti (yukarıda tarif edildi) burada gösterilmektedir. Tüm veriler Gauss dağılımı için test edildi ve gösterilen çizgiler, çizilen verinin ortalamasını göstermektedir. ( f ) 10 Gy IR + p65 siRNA ± AG-014699 (+ ile gösterilir) ile tamir edilen ve (0, 15 ve 30 dak.) tamir edilen U251 hücrelerinde SSB'lerin kapsamını gösteren dağılım diyagramları. SSB onarımı, alkalin COMET tahlili kullanılarak ölçüldü ve Olive Tail momenti (yukarıda tarif edildi) burada gösterilmektedir. Tüm veriler Gauss dağılımı için test edildi ve gösterilen çizgiler, çizilen verinin ortalamasını göstermektedir.

Tam boy görüntü

Daha sonra, yukarıda tarif edilen tedavilerin, enzim bağlı immünosorbent testi bazlı metot kullanılarak NF--B DNA bağlanması üzerindeki etkisini belirledik ve gözlemlerimizin p65 + / + MEF'lerde görülenlerle tutarlı olduğunu tespit ettik. 10 Gy IR, sahte işlem görmüş hücrelere kıyasla DNA bağlama aktivitesini iki kat arttırdı (Şekil 6c). Ayrıca, p65 siRNA tek başına veya AG-014699 ile birlikte, U251 hücrelerinde IR'yi takiben DNA bağlanmasını>% 85 azaltmıştır (sırasıyla, sadece IR ile karşılaştırıldığında P = 0.0003 ve P = 0.005). Önemli olarak, hem PARP-1 siRNA hem de AG-014699, muamele edilmemiş kontrollerle karşılaştırılabilir seviyelere IR kaynaklı DNA bağlanmasını azaltmıştır (sırasıyla, IR'ye kıyasla P = 0.0053 ve P = 0.0079). NS siRNA, IR sonrası DNA bağlanması üzerinde hiçbir etkiye sahip değildi.

Alkalin Comet tahlili, IR kaynaklı SSB oluşumunu incelemek ve U251 hücrelerinde tamir etmek için kullanıldı. 10 Gy IR'den hemen sonra, sadece IR veya p65 siRNA ile kombinasyon halinde IR ile muamele edilmiş hücreler aynı başlangıç ​​SSB seviyesine sahipti (Şekil 6e ve f). IR'den 30 dakika sonra U251 hücrelerinde veya U251 hücrelerinde kalan SSB seviyelerinde, IR6'da anlamlı bir farklılık yoktu, Şekil 6d'de gözlenen radyo duyarlılığında gözlenen farklılıklara rağmen>% 95'lik kırılmalar tekrar birleşti. Önemli olarak, AG-014699, p65 durumundan bağımsız olarak hücrelerde SSB onarımını (IR sonrası tüm zaman noktalarında artan SSB seviyelerinin artmasıyla gösterildiği gibi) engelledi (Şekil 6e ve f).

Tartışma

Bu çalışmada, PARP-1 devrilme ve PARP inhibitörü AG-014699'un p65 + / + MEF'lerde IR'yi takiben sağkalımı azalttığını ve apoptozu indüklediğini, p65 + / + MEF'lerde etkisinin olmadığını göstermiştir. Hassaslaşma 1.3 kat idi ve klinik olarak ilgili IR dozlarında önemli derecede oluştu. AG-014699 ve p65 nakavtının bir kombinasyonu, PARP-1 ve NF-κB'nin ortak bir yolda mekanik olarak bağlandığı raporlarıyla tutarlı olan bu cevabı daha da artırmadı (Hassa ve Hottiger, 1999; Chang ve Alvarez-Gonzalez, 2001). ; Stilmann ve diğerleri, 2009; Veuger ve diğerleri, 2009). IR tarafından indüklenen p65 + / + ve p65 - / - MEF'lerdeki SSB seviyeleri benzerdi ve her ikisi de tamirlerinde eşit derecede yetkindi. AG-014699, baz eksizyon onarımında PARP-1'in bilinen rolü ile tutarlı olarak, her iki hücre hattında da kırılma seviyesini aynı ölçüde arttırmayı başardı (Durkacz ve diğerleri, 1980). Bu nedenle, IR ile birlikte kullanıldığında AG-014699'un kuvvetlendirici etkisinin, öncelikle SSB onarımının yaygın olarak rapor edilen geçici inhibisyonu nedeniyle değil, PARP-1'in NF-κB'ye doğru aşağı yönlü sinyalleşmesinin bir sonucu olduğu sonucuna varabiliriz. Bu, DNA onarımında ciddi şekilde tehlikeye giren hücrelerin (örneğin, PARP-1 - / - ), WT benzerlerine kıyasla, sürekli olarak daha yüksek seviyede kırılmalara rağmen, bölünebilecek ve hayatta kalabilecekleri gözlemiyle tutarlıdır. eksojen hasarın tespiti (Trucco ve diğerleri, 1998). Bu veriler, IR kaynaklı DNA hasarının çekirdekte sinyal olaylarını başlattığını ve sitoplazmada devam ettiğini gösteren bulgularımızla birleştiğinde NF-κB'nin aktivasyonuna neden olarak (Veuger ve ark., 2009), bir ara sinyalin varlığını desteklemektedir. Stilmann ve diğ. (2009).

Comet testini kullanarak gözlemlediğimiz etkilerin SSB'lerden kaynaklandığına dair güçlü kanıtlar bulunmasına rağmen, alkalin Comet testinin SSB'lerin yanı sıra az miktarda çift iplik kopması tespit edebildiğine dair güçlü kanıtlar var. İlk olarak, Ogorek ve Bryant (1985), deneylerimizde kullanılan düşük IR dozlarında, SSB'nin çift sarmal kırılma oranının yaklaşık 20: 1 olduğunu göstermiştir. Ayrıca, daha önce PARP-1'in, DNA'ya bağlı protein kinaz yokluğunda homolog olmayan birleşme ile çift iplikli kopmaların onarımında küçük bir rolü olduğunu göstermiştik (Veuger ve ark., 2003). Bununla birlikte, burada kullanılan p65 + / + ve p65 - / - hücreleri fonksiyonel DNA-bağımlı protein kinaza sahiptir ve bu nedenle herhangi bir çift iplik kopması, homolog olmayan uç birleştirme ile onarılabilir, AG-014699 inhibisyondan tek başına sorumludur SSB’lerin

IR dışındaki uyaranlarla indüklenen NF-κB aktivitesi üzerindeki etkileri araştırmak için TNF-α kullandık. PARP-1 proteininin yıkılması, enflamatuar uyarıcıyı takiben NF-κB aktivasyonunu iptal etmesine rağmen, PARP-1 enzimatik inhibisyonunun hiçbir etkisi olmamıştır. Buna karşılık, IR kaynaklı NF-κB yanıtını inhibe etmek için PARP proteini ve aktivitesi gerekliydi. PARP-1 proteininin NF-κB ko-aktivatörü olarak katalitik aktivitesinin rolü tartışmalıdır. Verilerimiz bazı çalışmalarla tutarlıdır (Hassa ve diğerleri, 2001), ancak diğerleri PARP-1 inhibisyonunun, mikrogliadaki TNF-a ile uyarılmış NF-κB'ye bağımlı MMP-9 aracılı nörotoksisiteyi hafifletebileceğini göstermiştir. beyin hasarı (Kauppinen ve Swanson, 2005). Bu hücre hattı veya model sistemine bağlı olabilir ve diğer NF-κB alt birimlerinin aktivasyonuna bağlı olarak da değişebilir. Örneğin, yakın zamanda alt ünite aktivasyonunun CLL'de karmaşık denge olduğunu gösterdik (Mulligan ve diğerleri, 2010). Bununla birlikte, bu durumda PARP-1'in, Hassa ve ark.nm gibi NF-B transkripsiyonel kompleksinde yapısal bir rolü kolaylaştırması da mümkündür. (2005) PARP-1'in HDAC1 ve p300 ile asetilasyonunun NF--B aktivitesini düzenlediğini göstererek gösterilmiştir. Diğer bir açıklama PARP inhibisyonunun protein yıkımıyla karşılaştırıldığında farklı fizyolojik etkiler üretebileceğidir. Her ne kadar AG-014699 tarafından PARP-2 gibi başka PARP familyası proteinlerinin inhibisyonu kesin olarak göz ardı edilemezse de, burada gösterilen hem inhibitör çalışmalarından hem de PARP-1 yıkım çalışmalarından elde edilen verilerdeki tutarlılık bunun böyle olmadığını göstermektedir. Daha önce PARP-1 - / - hücrelerinin PARP aktivite tahlili kullanılarak ihmal edilebilir PAR oluşumuna sahip olduğunu göstermiştik (Veuger ve ark., 2009), bu nedenle buradaki bulgularımıza AG-014699'un PARP inhibisyonu yoluyla hücreleri radyo-duyarlılaştırdığı tespit edildi. 1, PARP-2 değil.

Her iki uyaran da benzer miktarlarda p65 nükleer translokasyonu ile sonuçlandığından ve bu, AG-014699 veya PARP-1 devrilme etkisinden etkilenmediği için, PARP-1'in IR- ve TNF-a-aktifleştirilmiş NF-κB için farklı gereksinimleri ortaya çıkmalıdır. DNA bağlama ve transkripsiyon aşaması. PAR polimerinin DNA hasarı ile aktive olan NF-KB içindeki gereksinimi kanıtlanmıştır (Stilmann ve diğerleri, 2009) ve bu, verilerimizle TN'nin TNF-α'nın polimer oluşumunu uyarmadığı ile tutarlıdır. Stilmann ve diğ. (2009) açıkça PAR polimer aracılığıyla aracılık edilen yeni bir hayatta kalma yanlısı NF-KB aktivasyon mekanizmasını tanımlamıştır. Gözlemlerimize dayanarak, daha ileri bir mekanizma önerebiliriz (Şekil 7). P65'in DNA bağlanma arayüzü, genellikle p65, DNA konsensüs sekansının negatif yüklü bölgesine yakın olduğunda, konformasyonel bir değişiklik meydana gelene kadar gömülür (Ghosh vd., 1999). PAR polimerinin büyük bir toplam negatif yüke sahip olduğu bilinmektedir (Ueda ve Hayaishi, 1985). DNA hasarı veya AG-014699 ile işleme tabi tutulduktan sonra nükleer p65 seviyelerinde bir değişiklik göstermediğimizi, ancak yine de p65 DNA bağlanmasının polimer oluşumunun uyarılmasıyla arttığını gösterdiğimiz için, polimer üzerindeki negatif yükün p65'de bu konformasyonel değişikliği tetiklediğini varsayabiliriz, böylece artan bağlanma ve transkripsiyonel aktivasyona yol açar (Şekil 5). Burada PARG inhibitörü ADP-HPD kullanarak sunduğumuz veriler bu hipotezi desteklemektedir. Polimer bozulmasının inhibe edilmesi sayesinde artan polimer stabilitesinin, NF-DNAB DNA bağlanmasının sürekliliğine, anti-apoptotik gen ekspresyonunda bir artışa ve IR kaynaklı hücre ölümüne karşı bir korumaya yol açtığını göstermektedir. Bu, PAR polimerinin DNA hasarını takiben NF-κB'nin aktivasyonundaki rolünü onaylar.

Image

PAR, DNA hasarı aktif NF-κB için esastır. ( a ) IR gibi DNA hasarı, PARP-1'i aktive ederek hasarlı DNA bölgesine götürür. Bu, negatif yüklü PAR polimerin oluşumuyla sonuçlanır. NF-κB p65-p50 heterodimer ayrıca, NF-canB aktivasyonunun kanonik yolunun aktivasyonu vasıtasıyla DNA hasarını takiben çekirdeğe de aktarılır. PAR polimeri gibi toplam negatif yüke sahip bölgelere yakın olduğunda, p65'deki bir yapısal değişiklik meydana getirilebilir, bu da p65'in pozitif yüklü DNA-bağlama arayüzünü ortaya çıkarır. Bu nedenle, p65'in DNA'ya bağlanmasını sağlayan PAR polimeri üzerindeki bu negatif yükün (PARP-1 ve polimer hasarlı DNA bölgelerine alındığında) koruduğunu ve NF-κB'ye bağımlı genlerin transkripsiyonunu değiştirdiğini öneriyoruz. apoptoza karşı ve telsiz direnci veren. ( b ) PARP inhibitörü, AG-014699 mevcut olduğunda, PARP-1 artık aktif değildir ve polimeri oluşturamaz. Bu nedenle, bu durumda, apoptoz indüksiyonu ve nihayetinde radyo-duyarlılaşma ile IR'den sonra DNA bağlanma ve transkripsiyonel aktivasyonda azalma görüyoruz.

Tam boy görüntü

NF-κB'nin inhibisyonu açıkça kanser terapötikleri için çekici bir hedeftir (Gilmore ve Herscovitch, 2006). Bununla birlikte, küresel inhibisyonun bazı olumsuz yönleri de olabilir. Örneğin, NF-κB'nin enflamatuar yanıtta hayati bir rolü vardır ve bu nedenle NF-inB'nin, örneğin bir IKK inhibitörü ile tamamen inhibe edilmesinin olumsuz etkileri olabilir. IKK kompleksi, hücre içerisinde birçok bilinen fonksiyona sahiptir (Chariot, 2009; Criollo ve diğerleri, 2010) ve inhibisyon sitotoksik olabilir. Long-term NF-κB inhibition may also increase the likelihood of immunodeficiency, because it has a pivotal role in the innate and adaptive immune response, and can possibly delay bone marrow recovery because of some reports of chemotherapeutic-induced apoptosis of hematopoietic progenitors (Grossman et al., 1999; Turco et al., 2004). The data here suggest that AG-014699 inhibits IR-induced NF-κB activation but not an inflammatory stimulus and thus may overcome these potential toxicities. Furthermore, ongoing gene expression analysis shows that AG-014699 has no effect on vital inflammatory response genes following TNF-α treatment (data to be published separately). Consequently, blockade of DNA damage-activated NF-κB by AG-014699 may therefore represent preferable therapeutic strategy, because we demonstrate here that the survival function of NF-κB can be directly inhibited without compromising other functions, such as the immune response.

AG-014699 has been shown to be efficacious both in vitro and in vivo (Plummer et al., 2008; Daniel et al., 2009; Zaremba et al., 2009; Drew et al., 2010) and is currently in phase II trials for BRCA defective breast and ovarian cancer as a single agent (//www.clinicaltrials.gov). AG-014699 was the first PARP inhibitor to enter clinical trial for cancer therapy and phase I trials showed that profound and sustained PARP inhibition could be achieved after a single intravenous infusion (Plummer et al., 2005a, 2005b). Phase II trials combining AG-014699 with temozolomide in metastatic melanoma patients showed an improvement in the response rate in comparison with temozolomide alone (Plummer et al., 2006). A number of pharmaceutical companies are now undertaking clinical trials of PARP inhibitors for the treatment of cancer (Drew and Plummer, 2009); however, this is the first investigation of the clinically relevant PARP inhibitors in the context of their potential utility as inhibitors of DNA damage-induced NF-κB activation.

Radio-therapy is one of the main-stays of therapy for glioblastoma multiforme, the most frequent and refractory adult brain tumor (Burger et al., 1985). Aberrant activation of NF-κB is known to have a role in the tumorigenesis of both diffuse and high-grade gliomas (Kanzawa et al., 2003; Wang et al., 2004). Hence, here we have used the glioblastoma cell line, U251, to highlight the potential utility of AG-014699 in inhibiting DNA damage-activated NF-κB in tumor cells.

In summary, this is the first report to demonstrate that a very potent and specific PARP-1 inhibitor, AG-014699, can re-sensitize cells to irradiation and that this is mediated directly via NF-κB, rather than the inhibition of SSB repair. These data present a novel mechanism for PARP-1 in the regulation of NF-κB and highlight important new therapeutic avenues for the use of PARP inhibitors, which may prove useful in overcoming NF-κB-mediated therapeutic resistance.

Malzemeler ve yöntemler

Hücre çizgileri ve reaktifler

The p65 +/+ and p65 −/− MEFs were kindly provided by Professor Ron Hay, Dundee University, UK. PARP-1 +/+ and PARP-1 −/− MEFs were a gift from Professor Gilbert de Murcia, École Superieure de Biotechnologie de Strasbourg, France. All of the above cell lines were cultured in RPMI-1640 medium (supplemented with 10% (v/v) fetal calf serum and 2 m M glutamine). The p65 −/− control MEFs, and the MEFs that have been genetically complemented with WT protein were a kind gift from Professor Neil Perkins, Newcastle University, UK. These were cultured in Dulbecco's modified Eagle's medium medium (supplemented with 10% (v/v) fetal calf serum, 2 m M glutamine and 4 μg/ml Puromycin). The U251 glioblastoma cell line was donated by Dr Gareth Veal, Newcastle University, UK, and was cultured in Dulbecco's modified Eagle's medium medium (supplemented with 10% (v/v) fetal calf serum and 2 m M glutamine).

PARP-1 Inhibitor. AG-014699 was synthesized by Pfizer GRD, La Jolla, CA, USA. AG-014699 was dissolved in anhydrous dimethylsulphoxide (Sigma, Dorset, UK) at a stock concentration of 10 m M and stored at −20 °C. AG-014699 was added in cell culture such that the final dimethylsulphoxide concentration was kept constant at 0.1% (v/v), and was used at a final concentration of 0.1 μ M in all experiments.

PARG inhibitor. ADP-HPD was purchased from ENZO Life Sciences, Exeter, UK. It was dissolved in sterile H 2 O (Gibco, Paisley, Scotland) at a stock concentration of 5 mg/ml and stored at −20 °C. ADP-HPD was added in cell culture at a final concentration of 1 μ M in all experiments.

siRNA transfeksiyonu

Cells were seeded in six-well cell culture plates at a density of 5 × 10 4 in 2 ml and incubated overnight. siRNA targeting human p65 (5′-GCCCUAUCCCUUUACGUCA-3′); or PARP-1 (5′-GGAGGAAGGUGUCAACAAA-3′; both from Dharmacon, Cramlington, UK) was transfected at a final concentration of 50 n M using Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Paisley, UK), according to the manufacturer's instructions. Controls used included NS siRNA and mock/vehicle only transfected cells. p65 or PARP-1 knock down was confirmed by western analysis (Figure 1).

PARP activity assay

PARP activity was determined in cells transfected with siRNA (or relevant controls, as described above), which had been treated with AG-014699 or dimethylsulphoxide, using a validated assay (Plummer et al., 2005a, 2005b; Zaremba et al., 2009). Briefly, basal PARP activity present in cells was measured in 1 × 10 4 permeabilized cells that had been incubated with NAD + and oligonucleotide (to maximally stimulate PARP activity) (Sigma). PARP activity was also assessed following treatment with IR or TNF-α, by omitting the oligonucleotide stimulation step. The reaction was terminated with excess AG-014699, and replicate samples ( n =3) were blotted onto nitrocellulose membrane (Hybond N, Amersham, UK). A standard curve of purified PAR polymer (pmol of PAR) (Biomol, Exeter, UK) was also blotted to aid with quantification. The membrane was probed with PAR-specific antibody (10 H, a kind gift of Professor Burkle, University of Konstanz, Germany) and chemiluminescence was detected using a 5-min exposure on the Fuji-LAS 3000 CCD camera (Raytex, Sheffield, UK). Images were analyzed using Aida Imaging Analyzer (Raytest, Chesterfield, UK). Data was normalized to mock- (vehicle alone) treated controls and results shown are the mean of three independent experiments.

Batı lekesi

Proteins were resolved on 4–20% (v/v) Tris-glycine gradient gels (Invitrogen Ltd) and electrotransferred onto nitrocellulose (Hybond C, Amersham, UK). Antibodies against PARP-1 (H-250), p50 (8414), p65 (8008) were purchased from Santa Cruz Biotechnology, (Santa Cruz, CA, USA). As loading controls, actin antibody (CP01; Calbiochem, Nottingham, UK) was used for whole cell extracts, lamin A/C (7293; Santa Cruz Biotechnology) for nuclear extracts and α-tubulin for cytoplasmic extracts (Sigma). This was followed by binding of peroxidase-conjugated goat anti-mouse/rabbit antibody (DAKO, Ely, UK) and detection by enhanced chemiluminescence (Amersham, UK). Cells were pretreated with AG-014699 for 1 h and exposed to IR. Cells were harvested at different time points and whole cell extracts were taken using sodium dodecyl sulfate lysis buffer (100 m M Tris–Hcl pH 6.8, 20% v/v glycerol, 4% w/v sodium dodecyl sulfate). Nuclear and cytoplasmic extracts were prepared using the NE-PER extraction kit as per the manufacturer's instructions (Pierce-Perbio Science, Cheshire, UK). α-Tubulin was not detected in nuclear extracts and conversely, lamin was absent in all cytoplasmic extracts thus demonstrating the efficient separation of nuclear extracts. Bands were quantified and normalized to their relevant loading controls using densitometry (Fuji LAS 3000 Imaging).

Sitotoksisite analizi

Clonogenic assays were carried out as described previously (Veuger et al., 2003) and cloning efficiencies were normalized to untreated controls. PF 50 (potentiation factor at 50% cell kill) values were calculated from the ratio of the individual LD 50 (lethal dose producing 50% cell kill) values: that is, LD 50 divided by LD 50 in the presence of AG-014699.

Annexin-V flow cytometry

Apoptosis was measured using the FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I (BD Biosciences, Oxford, UK), as per the manufacturer's instructions. Briefly, cells were transfected with p65 siRNA (or relevant controls) 48 h before to 1 h pretreatment with AG-014699 and subsequent irradiation. Cells were harvested and resuspended in 100 μl binding buffer (0.01 M Hepes/NaOH (pH 7.4), 0.14 M NaCl, 0.25 m M CaCl 2 ). Fluorescein isothiocyanate annexin V and propidium iodide staining solution were added and cells were incubated for 15 min at room temperature, in the dark. Cells were analyzed using the Becton Dickinson FACScan (Becton Dickinson, Oxford, UK) and Cell Quest Software (Becton Dickinson). Results are the mean of three independent experiments.

COMET assay

Following IR treatment, SSB levels were quantified using the alkaline Comet assay (Trevigen, Gaithersberg, MD, USA) following the manufacturer's protocol. Briefly, cells were washed and resuspended in ice-cold phosphate-buffered saline before mixing with proprietary low melting point agarose (37 °C). This mixture was pipetted onto a CometSlide (Trevigen) and allowed to gel at 4 °C. Following lysis, slides were subjected to electrophoresis under alkaline conditions at 20 V for 40 min and then fixed, dried, and stained with SYBR Green I. An Olympus BH2-RFCA fluorescence microscope ( × 10 objective) (GX Optical, Suffolk, UK) with Hamamatsu ORCA II BT-1024 cooled CCD camera (Hamamatsu Photonics, Massy, France) was used to capture images. Image Pro Plus (Media Cybernetics, Bethesda, MD, USA) was used for image capture and analysis was performed using Komet software v 5.5 (Kinetic Imaging, Nottingham, UK). Data for repair kinetics were expressed as a percentage, with 100% representing the mean number of breaks at time 0 post-IR treatment, in the presence of absence of AG-014699. Subsequent time points are expressed as a percentage of the time 0 point.

NF-κB DNA-binding assay

NF-κB p65 DNA-binding activity was determined using an enzyme-linked immunosorbent assay-based EZ detect assay according to the manufacturer's instructions (Promega Southampton, UK). Briefly, streptavidin-coated 96-well plates are bound with biotinylated κB consensus sequence oligonucleotides (5′-GGGACTTTCC-3′). Cells were transfected with siRNA, or relevant controls 48 h before a 1 h pretreatment with AG-014699 and subsequent irradiation. In all, 5 μg of nuclear extracts (prepared 2 h after irradiation, as described above) were added to each well and incubated with primary antibody specific for p65. Binding was detected using a secondary horseradish peroxidase-conjugated antibody and chemiluminescence measured using a CCD camera (LAS-300; Fujifilm). Purity of cytoplasmic and nuclear extracts was confirmed as described above.

Reporter gene assay

Cells were seeded onto 24-well plates and incubated for 24 h. Cells were transiently transfected with 200 ng of an NF-κB-luciferase construct containing three tandemly repeated NF-κB consensus sequence-binding sites in the promoter (Professor Ron Hay, Dundee University), together with 200 ng of a pCMB-β-galactosidase plasmid containing a minimal promoter element up-stream from the β-galactosidase gene, using Lipofecamine 2000 (Invitrogen) for 6 h. siRNA transfection was undertaken simultaneously, as described above. At 48 h after transfection, cells were treated with AG-014699 for 1 h before IR. Following 8-h incubation, cells were lysed and assayed for luciferase activity according to the manufacturer's instructions (Promega, Southampton, UK). Luciferase activity was corrected for β-galactosidase activity as described previously (Brady et al., 1999), and relative activities expressed as fold changes.

Ek bilgi

Görüntü dosyaları

  1. 1.

    Ek Şekil S1

  2. 2.

    Ek Şekil S2

  3. 3.

    Ek Şekil S3

  4. 4.

    Ek Şekil S4

Word belgeleri

  1. 1.

    Ek Şekil Efsaneleri

    Ek Bilgi Oncogene web sitesinde (//www.nature.com/onc) makaleye eşlik eder